纽约，2026年10月29日——当光线深入脑组织时会发生散射。目前最先进的三光子显微技术能够减少由此产生的背景荧光，并在理论上实现比以往技术更深层的成像。然而，该技术需要使用较高的平均激光功率，这会导致组织过热并损伤活体组织。

与接受这种权衡不同，洛克菲勒大学的一个团队从零开始重新设计了整个成像系统。该平台名为“三光子超深成像”（TrUDI），通过重新设计激光脉冲的速率和能量、脉冲在样本上的传输方式及扫描方法，在确保样本功率暴露处于安全范围内的前提下，将三光子成像技术推向了其理论极限。其结果是成像效率提高了约250倍，使研究人员无需手术切除表层组织，即可对小鼠整个大脑皮层进行成像，并记录海马体和纹状体等深层脑区的神经活动。

使用Vaziri实验室新平台三光子超深成像（TrUDI）拍摄的叠加图像的体绘制。图片由洛克菲勒大学Vaziri实验室提供。

“在科技领域，人们常常因历史原因固守某种激光或参数，而大家也都默认这些限制。”神经技术与生物物理实验室负责人阿里帕沙·瓦齐里表示，“我们希望从零开始重新设计。通过不将任何因素视为理所当然，并提出一个从零开始、完全优化以最大化三光子成像深度的系统会是什么样子的问题，我们发现，以往被认为限制性的因素其实是可以克服的。”

神经科学面临的最大挑战之一，就是理解大脑深处不同神经元群体如何协同工作以产生行为。尽管现代显微镜能够记录活体动物脑表面附近单个神经元的活动，但对大脑深层广泛区域的成像一直十分困难，因为脑组织会散射光线。随着光向更深的区域传播，神经元与背景荧光之间的区分变得愈发难以实现。

多年来，研究人员通过越来越先进的荧光显微技术不断突破这一极限，这类技术利用人工设计的分子在激光照射下发出光信号。其中，三光子显微技术是该领域最重要的成果之一，理论上可比其他方法（包括更常用的双光子显微技术）实现更深的成像，因为它产生的背景荧光更少。然而，使用三光子显微技术达到这些深度仍面临实际限制。

“三光子激发中脉冲能量需求更高，这最终限制了在通常使用的激光重复频率下，可以向大脑注入多少激光功率而不造成损伤，”瓦齐里表示。“你受到热量的限制，同时由于散射，到达目标的光子数量呈指数级减少，导致荧光信号与背景变得难以区分。”

三光子显微成像旨在扩展更广泛应用的双光子显微成像约0.8毫米的深度范围，但其性能一直未能达到潜力。“在任何多光子激发方案中，都会存在一个深度极限，此时背景与信号趋于相等。对于小鼠脑部的三光子激发，理论上这一深度极限应约为2.3毫米，”瓦齐里表示，“但此前实现功能记录的最大深度仅为约1.2毫米。”

瓦齐里决定从零开始重新设计成像系统。他的团队首先利用计算机模型，确定了深部脑成像的理论极限，并分析了显微镜应如何设计才能接近这些极限。在这些计算的指导下，他们重新回到设计图纸，对三光子显微技术的各个方面进行了优化，特别是通过减少激光脉冲数量但提高能量密度，同时保持相同的平均激光功率，并重新设计显微镜的聚焦和集光方式。他们甚至开发出一种激发方案，仅当激光脉冲经过神经元时才激活，从而在长时间实验中将激光暴露时间最多减少80%。

“我们采用了一系列非常系统、基于原理且从基础做起的优化方法，”瓦齐里说，“我们尽量不随意假设显微镜或激光参数的选择，所有参数都严格依据其最终目标来确定——即在确保样本处于安全激光暴露范围内的同时，最大化深度成像能力，并准确分辨单个神经元的瞬态活动。”

这些优化措施相加后效果显著。最终成果——TrUDI平台——在不依赖提高激光功率（这可能导致脑组织发热和损伤）的情况下，荧光产生效率提升了约250倍。“从单个参数来看，光学调整可能仅带来四到五倍的提升，而当面对一个指数级困难的问题时，这种提升很容易被忽略，”他说，“但如果你拥有足够多的这类优化，并且每项改进都是乘法叠加的，那么突然间你就能获得高达200倍的性能提升。”

随后，团队利用TrUDI系统在小鼠身上验证了该新系统，成功成像了海马体和纹状体深层结构中不同皮层深度神经元群体的活动，最深可达完整哺乳动物大脑内2.1毫米的组织深度——远超此前约1.2毫米的极限。这是首次无需通过手术切除表层皮层，即可实现对海马体多个相互连接区域以及纹状体深层区域活动的成像。

对脑组织进行的分析旨在检测热相关损伤及其他损伤迹象，但在研究所采用的成像条件下，并未发现炎症、神经元损失或DNA损伤的证据，证实TrUDI能够安全地探测到此前被认为无法实现的深层脑区。

因此，TrUDI也为那些以往难以触及的脑回路提供了观察窗口。“纹状体中存在一些无法进入的区域，还有许多深部脑核仍位于更深位置，需要侵入性手段才能到达。”瓦齐里表示，“但我们的研究使一系列此前只能通过侵入性方法成像的脑区变得可及，而无需此类侵入操作。”

该研究发表于《自然·方法》

发布于：2026年10月